单细胞转录组助力构建不同胃腺癌亚型的转录组图谱

单细胞转录组助力构建不同胃腺癌亚型的转录组图谱

　　景观双休吗,秋日微景观,景观成啊肿瘤异质性，包括形态异质性和遗传异质性，是癌症研究的一个重要课题。胃腺癌（GA）是胃癌的一个典型异质性恶性疾病的例子，具有不同的亚型和临床表现。根据腺体结构异型性和GA粘膜的分化程度，可以将GA分为肠道型和弥漫型。肠型GA的特征是形成腺体结构，并表现出不同程度的分化，这些分化通常通过具有良好特征的连续病理阶段形成，如慢性胃炎（CG）、萎缩、肠化生和发育不良。弥漫型GA通常表现出低分化状态，以低分化浸润性生长为特征，与攻击性行为和不良预后相关。但是，与胃肿瘤生物学行为相关的表型表达的分子基础仍知之甚少，限制了肿瘤异质性的分离。

　　单细胞RNA测序（scRNA-seq）和微流控技术的最新进展为描述数千个细胞的转录状态提供了方法。该方法允许对生物组织内的细胞特征进行无偏分析，并已广泛应用于包括癌症免疫异质性在内的肿瘤生态系统分析。

　　作者利用10x Genomics单细胞转录组技术对来自9例胃肿瘤和3例非肿瘤样本的27,677个细胞进行单细胞转录组分析，在单细胞分辨率下构建不同胃腺癌亚型的转录组图谱，描述了肿瘤内部和肿瘤之间细胞分化程度各异，预测了肿瘤细胞分化程度与预后的关系；并对非恶性上皮细胞进行细胞谱系演进关系的分析，揭示了胃化生细胞（SPEM）来源于主细胞的去分化，其结果有助于阐明胃癌发生的机制。

　　材料：对来自9个肿瘤和3个非肿瘤样本的27,677个细胞进行了scRNA-seq分析。使用大规模组织学分析和大量转录组数据集验证分析结果；

　　通过对12例样本的单细胞测序，将细胞划分为14个聚类。这些簇可通过标记基因（图1C-E）分配给九个已知细胞系：上皮细胞（10411个细胞，37.6%，用EPCAM、KRT18和KRT8标记）、壁细胞（215个细胞，0.8%，用ATP4A标记）、内分泌细胞（486个细胞，1.8%，用CHGA标记）；B细胞（6131个细胞，22.1%，用MS4A1和CD79A标记）；T细胞（6819个，占24.6%，标记有CD2、CD3D和CD3E）；巨噬细胞（1053个细胞，3.8%，以CD14标记）；肥大细胞（527个，占1.9%，用CPA3标记）；成纤维细胞（1116个细胞，4.0%，用ACTA2和COL1A2标记）；内皮细胞（919个细胞，3.3%，用ENG和VWF标记）。每个细胞谱系的比例在不同样本之间差异很大（图1F）。

　　为了区分恶性上皮和非恶性上皮，作者根据TCGA胃腺癌（STAD）数据集中成对肿瘤和正常组织样本之间的差异表达基因定义了每个上皮细胞的初始恶性和非恶性评分。最后，鉴定了5635个恶性上皮细胞和4776个非恶性上皮细胞（图2A-C）。一组肿瘤特异性基因（图2D-F），包括CLDN4、CLDN7、TFF3和REG4，发现恶性上皮与非恶性上皮相比上调（p?16)。非恶性上皮表现出与胃粘液和消化酶分泌相关的标记基因的高表达，如MUC5AC、GKN1、PGC和LIPF（图2D-F，p?16)。为了破译恶性上皮和非恶性上皮的分子特征差异，作者进行了GSEA富集分析。与非恶性上皮相比，恶性上皮富含肿瘤坏死因子factor-α/nuclear factor-kappa B、KRAS和白细胞介素-6/Janus激酶/信号转导子和转录激活子等信号通路（图2G）。还有其他对癌症发展和进展至关重要的丰富基因集，如MYC靶点、上皮间质转化和血管生成（图2G）。

　　慢性炎症引起的癌前胃化生一直是胃癌发生研究的热点。有研究报道，主细胞可能异常分化为颈部细胞，然后由于壁细胞的丢失而导致粘液细胞化生，称为SPEM。与正常胃组织相比，在癌组织和CG粘膜组织样本中很少检测到表达ATP4A和ATP4B的壁细胞(图1E)。

　　通过对非恶性细胞进行了亚聚类分析，发现了四个不同的组(图3A)。G1组细胞占细胞总数的78.0%，通过TFF2、GKN1和MUC5AC基因表达可区分为表面细胞(图3C)。G2组细胞PGA3、PGA4、LIPF等标记基因表达量高，被定义为主细胞(图3C)。这些细胞缺乏bHLH转录因子MIST1的表达，这对主要的细胞成熟至关重要。另外，还发现G3细胞表达标记物PGA3和MUC6，可定义为增生性/肥厚性黏液颈部细胞（免疫染色也验证了表达，图3E)。G4主要由癌病灶粘膜的细胞组成。这些细胞的特点是高表达水平的颈部细胞标记物MUC6。接下来，作者使用Monocle分析工具包进行细胞轨迹分析，以进一步研究细胞类型之间的潜在转变。来自Monocle的伪时间轨迹轴表明主细胞可以转分化为粘膜颈细胞，然后分化为SPEM(图3F)。特定代表性基因的拟时间动态表达也标志着主细胞向粘膜颈部细胞发展，然后进入SPEM(图3G B)。本文的结果首次描述了主细胞在单细胞水平上的潜在分化途径，并表明它们可能产生化生细胞(图3H)。

　　通过对5635个恶性细胞聚类分析，发现五个显著的细胞亚群（C1-C5）。恶性细胞主要根据Lauren的组织病理学类型和背景因素（EBV感染）进行分组（图4A）。结果显示，九名患者的C1-C5比例有所不同（图4C）。C1几乎全部（96.9%）来自弥漫型样本（DGC）的恶性细胞，而C2主要来自肠型样本（IGC）（97.1%）（图4B）。C3含有混合型（MGC）和肠型样本细胞的混合物（图4B）。C4主要来源于一个肠道型GC样本（IGC3），C5包括来自EBV+患者（IGC5）的细胞（图4B）。通过比较基因表达谱（图4D），发现C1/C2/C3与Lauren分类的三个典型亚型一致，C4/C5是两个新的细胞亚群，与C1/C2/3相比具有不同的分子特征（图4A）。

　　众所周知，胃肿瘤表现出不同程度的分化。测序数据显示，上皮分化相关基因KRT20在肿瘤细胞中的表达是不同的。为了定量探讨肿瘤内部和肿瘤之间恶性细胞的分化异质性，作者定义了基于KRT20及其正相关基因（即PHGR1、MDK、CHDR2、RARRES3、GPA33、SLC5A1和MUC13的分化评分。不同亚组和患者的分化评分不同（图4F），显示出高度的肿瘤间异质性。值得注意的是，作者还发现了IGC1和IGC4等患者的肿瘤内分化异质性较高，其中包含两个具有不同分化分数的不同细胞组（图4H）。此外，IGC1和IGC4的恶性细胞从低分化程度到高分化程度显示出相似的拟时间轨迹（图4H）。结果表明，IGC1和IGC4中不同的细胞群可能代表两个不同的分化阶段。接下来，结合大量转录组数据（TCGA STAD数据集）中评估肿瘤分化程度与患者预后的相关性。对408名患者的生存分析显示，低分化评分可显著预测更差的总体生存率（图4I）。这支持低分化程度的胃肿瘤可能更具侵袭性。

　　接下来，作者研究了C1、C2和C3的分子特征（图5A）。C1高表达一些在胃上皮细胞中广泛表达的基因（如CLDN18和TFF2）（图5B），但在C2中很少检测到这些基因。相反，C2表现出与小肠相似的重要分子特征，这是由肠细胞标记物（如APOA1和FABP2）的广泛表达支持的（图5C）。这些结果也通过KRT20和CLDN18免疫染色进行了验证。C3没有显示明确的分子特征，但部分表达了C1和C2的两个标记，表明它是C1和C2的中间亚群，而不是C1和C2的混合物。此外，三个亚组之间的分化分数不同（图5D）。PHGR1、KRT20和MDK的表达水平在C2中最高，在C3中中等，但在C1中最低（图5E）。这些结果表明，C1代表未分化状态的亚群，而C2代表具有成熟肠细胞特征的高分化恶性细胞的不同亚群，C3代表C1和C2之间的中间状态。作者的结果描绘了单细胞分辨率下不同Lauren组织学类型的独特分子特征。

　　C4的恶性细胞（图6A）主要来源于肠型GA样本IGC3（图4C）。H&E染色结果显示肿瘤部位位于胃底腺，主要由分化的颗粒细胞组成。单细胞测序数据显示C4广泛表达主要细胞标记物（例如，LIPF、PGC和PGA3，图6B），并表现出中等水平的分化分数（图5D）。作者鉴定了一些在C4中特异表达的基因，其中一些被报道调控Wnt/β-连环蛋白信号通路，即RNF43（图6B）。GO富集分析证实C4中的特征基因富集用于调节生长和Wnt/β-连环蛋白信号通路（图6C）。免疫荧光染色显示，这些细胞主要位于胃腺基底部，MUC6和胃蛋白酶原-I（PGA3）强烈共表达（图6D）。C4亚组细胞的组织病理学表现和表型表达模式与GA-FG-CCP的细胞特征高度一致。

　　C5亚群几乎完全由EBV感染的肠型患者(IGC5)的细胞组成(图7A和4C)。C5中的绝大多数细胞显示出独特的分子特征：例如高水平的淋巴细胞抗原-6 (Ly6)家族成员(如LY6K)和MHC-II基因(HLA-DPA1和HLA-DPB1)(图7B)，它们与免疫反应紧密相连。GO富集分析表明，该亚群具有高水平的免疫相关信号通路，如IFN-α应答、抗原加工和呈递(图7D)，提示免疫细胞和肿瘤细胞之间可能存在细胞-细胞通信。免疫染色实验也证实了作者的发现，HLA II类分子和LY6K在EBV+病例中表达水平高于EBV?病例(图7E)。TCGA批量测序结果也显示，HLA II类分子在EBV+样本中高表达(图7G)。此外，由于EBV感染B细胞，作者比较了EBV+和EBV?患者B细胞的周期阶段，发现IGC5比EBV?患者有更多的S和G2M期细胞 (图7H)。总之，作者的分析揭示了EBV病毒感染GA患者恶性细胞的独特分子特征，这强调了EBV病毒诊断对于GA的组织学分类的必要性。

　　综上所述，作者从9例GA和3例非恶性胃粘膜样本中构建了27677个细胞的综合单细胞转录组图谱。针对上皮细胞，确定了一组区分良性上皮和恶性上皮的生物标记物。潜在主细胞转变的结果有助于阐明胃癌发生的机制，还描述了肿瘤内部和之间的不同分化程度，并预测了低分化程度患者的不良预后。此外，使用scRNA序列和批量转录组数据集鉴定了GA-FG-CCP和EBV+GA。通过将Lauren病理类型与肿瘤分子特征相结合，在临床上为胃腺癌的诊断和预后评估提供了宝贵的参考资料，为胃肿瘤异质性的研究提供了有价值的资源。以单细胞转录组谱为特征的GA分子谱可能为解剖肿瘤异质性铺平道路，并对临床实践产生影响。

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